Extracción del Ácido Nucleico

Tema del Articulo: Método de la PCR para la identificación de especies de Candida en aislamientos clínicos.

Introducción

La incidencia de fungemias causadas por especies levaduriformes en pacientes inmunodeprimidos susceptibles, y la poca sensibilidad del cultivo de sangre convencional para detectar el crecimiento levaduriforme ha hecho necesario el desarrollo de enfoques alternativos para la detección temprana y la identificación de las especies causantes más importantes. De estas C. Albicans a sido reconocida como la principal y la más común de las especies relacionadas a las candidiasis, que supone entre el 80 y 90% de las causas de fungemias  diagnosticadas.

Debido a su gran sensibilidad y especificidad, el método molecular de la PCR está resultando exitoso, algunos laboratorios lo han implementado para la tipificación de aislamientos de Candida, señalándolo como una rápida y segura  herramienta para la identificación de varios hongos patógenos.

Tipo de muestras clinicas:

• De la mucosa oral.
• De la superficie de materiales protésicos o catéteres.
• Expectoraciones o fluidos de pacientes con sospecha de candidiasis sistémica o diseminada.

Pasos para la extracción de DNA

Para cada reacción, fue tomada una colonia de Candida directamente de un cultivo puro de cada aislamiento a ensayar crecido en agar dextrosa Sabouraud por 24h a 37°C y esta fue resuspendida en un vial cpm 300 µL de amortiguador de fosfatos.

1.-Lisis

Para degradar completamente la pared de los hongos se añadieron 125 U de liticasa, y se incubó por 30 min a 37°C agregando posteriormente proteinasa K y 100 µL de solución de extracción incubando nuevamente durante 12h a 65°C.

2.-Separación

Para la extracción y purificación del DNA fue utilizada la técnica de remoción de proteínas con fenolcloroformo

3.-Purificación

Para la precipitación del DNA fue añadido y lavado con 1mL de isopropanol absoluto frío seguido de etanol frío al 75%, centrifugando entre cada lavado a 14.000 rpm durante 10 min a 4°C.

4.-Análisis

El etanol se retiró, se desecó el DNA al aire libre durante 30 min y se resuspendió, cuantificó y ajustó a una concentración de 0,25 a 1 mg/µL para su posterior amplificación.

Las muestras de DNA obtenidas fueron conservadas a -80°C por tiempo indefinido hasta su utilización.

PCR - Picture